Передача сигнала и вторичные мессенджеры. Вторичные посредники (мессенджеры) Первичные и вторичные посредники физиология

Жизнь любой клетки, включая глобальные процессы ее роста, деления и даже гибели, зависит от внешних регуляторных сигналов, которые она воспринимает. Такими сигналами могут быть физические воздействия (температура, ионизирующее и другое электромагнитное излучение) или многочисленные химические соединения. Хорошо изученными веществами, которые организм использует для регуляции жизнедеятельности клеток, являются, например стероидные гормоны, цитокины или факторы роста, которые, достигая клеток-мишеней, вызывают в них специфические метаболические изменения, связанные в том числе и с изменением экспрессии больших групп генов. Не менее сильный и часто также специфический ответ вызывают различные физиологически активные вещества экзогенного происхождения, например феромоны или токсины. Все эти сигналы, передающиеся через соответствующие сигнальные молекулы, являются первичными по отношению к тем каскадам биохимических реакций, которые запускаются в клетках в ответ на их воздействие. Первичные сигналы распознаются клетками благодаря наличию у них специальных молекул-рецепторов белковой природы, взаимодействующих с первичными сигнальными молекулами или воздействиями физической природы. Первичный сигнал, как правило, не действует прямо на те метаболические процессы в клетке, для регуляции которых он предназначен. Вместо этого воспринимающий его рецептор инициирует образование в клетке промежуточных химических соединений, запускающих внутриклеточные процессы, воздействие на которые было целью первичного внеклеточного сигнала. Поскольку такие промежуточные соединения несут в себе информацию о первичном регуляторном сигнале и являются вторичными его переносчиками, они получили название вторичных мессенджеров. Ими могут быть различные ионы, циклические нуклеотиды, продукты деградации липидов и целый ряд других химических соединений биогенного происхождения.

Использование эукариотами системы вторичных мессенджеров переводит их на новый уровень интеграции всех метаболических и катаболических процессов, что необходимо для существования многоклеточных организмов. В частности, вторичные мессенджеры позволяют многократно усиливать первичный регуляторный сигнал от внеклеточных регуляторных молекул, которые благодаря этому осуществляют свое действие, находясь в небольших концентрациях во внеклеточном пространстве. Кроме того, многие группы клеток и тканей приобретают способность к однотипной и одновременной реакции на первичный регуляторный сигнал, например на действие гормона какого-либо органа эндокринной системы. Это обеспечивает возможность быстрой адаптации многоклеточного организма к изменяющимся условиям внутренней и окружающей среды.

Трансмембранный перенос первичных сигналов

Для того чтобыьпервичный регуляторный сигнал достиг ядра и оказал свое воздействие на экспрессию генов-мишеней, он должен пройти через двухслойную мембрану именно тех клеток, которым он предназначен. Как правило, это достигается благодаря наличию на поверхности клеток рецепторов белковой природы, специфически выбирающих из окружающей среды сигналы, распознать которые они в состоянии (Рис. 2). В простейшем случае, когда в качестве низкомолекулярных регуляторов выступают гидрофобные химические соединения, растворимые в липидах мембран (например стероидные гормоны), для их переноса не используются рецепторы, и они проникают в клетку путем радиальной диффузии. Внутри клеток такие соединения специфически взаимодействуют с белковыми рецепторами, а образующийся комплекс переносится в ядро, где оказывает свое регуляторное воздействие на транскрипцию соответствующих генов (Рис. 2а). В отличие от этого рецепторы мембран, ориентированные во внеклеточное пространство, обладают способностью осуществлять транспорт лиганда-регулятора внутрь клеток посредством эндоцитоза (поглощения путем втягивания мембраны) комплекса лиганд-рецептор в составе мембранных везикул. Такой механизм используется, в частности, для переноса внутрь клеток молекул холестерина, ассоциированных с рецепторами липопротеинов низкой плотности (Рис. 2б). Другой тип рецепторов, ориентированных на внеклеточные лиганды, - это трансмембранные молекулы или группа молекул. Взаимодействие с лигандом внешней части таких молекул сопровождается индукцией ферментативной активности, ассоциированной с внутриклеточной частью того же самого полипептида (Рис. 2в). Примерами подобных рецепторов, обладающих активностью тирозиновых протеинкиназ, являются рецепторы инсулина, эпидермального фактора роста или фактора роста тромбоцитов. В синапсах нейронов и местах контакта нейромышечных тканей лиганды-нейромедиаторы (например ацетилхолин или г-аминомасляная кислота) взаимодействуют с трансмембранными ионными каналами (Рис. 2г). В ответ на это происходит открытие ионных каналов, сопровождаемое перемещением ионов через мембрану и быстрым изменением трансмембранного электрического потенциала. Другие трансмембранные рецепторы осуществляют связь белков внеклеточного матрикса с микрофиламентами цитоскелета клеток и регуляцию формы клеток, зависящую от внеклеточного матрикса, их подвижности и роста (Рис. 2д). Наконец, большая группа внеклеточных сигналов распознается рецепторами, ассоциированными на внутренней поверхности мембраны с GTP-связывающими белками, которые, в свою очередь, в ответ на первичный сигнал начинают синтез вторичных мессенджеров, регулирующих активность внутриклеточных белков (Рис. 2е). Классификация по структурному признаку рецепторов, осуществляющих перенос сигнала в клетки через мембраны, приведена в Табл. 1.

Все рецепторы, участвующие в трансмембранной передаче сигнала, подразделяют на три класса. При этом, как правило, учитывается сходство или различие вторичных структур субъединиц, а не особенности их аминокислотных последовательностей.

Рис. 2

Y и Y-P - нефосфорилированные и фосфорилированные остатки Tyr в белках соответственно. Показано также превращение предшественника X во вторичный мессенджер Z

Таблица 1. Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала

Рецепторы 1-го класса образуют олигомерные структуры вокруг пор в мембранах. Перенос сигнала в этом случае происходит в результате открытия или (в одном случае) закрытия ионных каналов. Основная часть рецепторов 2-го класса погружена в мембраны, и каждая из субъединиц содержит последовательности, распознаваемые G-белками. Для всех субъединиц этого класса характерно наличие трансмембранной (ТМ) последовательности, которая 7 раз пересекает мембрану. Субъединицы рецепторов 3-го класса минимально погружены в мембраны, что обеспечивает подвижность рецепторов и возможность их интернализации (перехода в цитоплазму клеток в составе мембранной везикулы). Большая часть полипептидных цепей этих субъединиц экспонирована наружу клеток.

Вторичные мессенджеры

Гипотеза о том, что действие гормонов на метаболизм клеток и экспрессию генов опосредуется внутриклеточными вторичными мессенджерами, впервые появилась после открытия в конце 1950-х годов Е. Сазерлендом циклического аденозин-3",5"-монофосфата (cAMP). К настоящему времени список вторичных мессенджеров расширился и включает циклический гуанозин-3",5"-монофосфат, фосфоинозитиды, ионы Ca 2+ и H + , метаболиты ретиноевой и арахидоновой кислот, закись азота (NO), а также некоторые другие химические соединения биогенного происхождения.

Как было упомянуто выше, внеклеточные сигналы, воспринимаемые рецепторами на поверхности клеток, запускают цепь внутриклеточных биохимических реакций, опосредуемых вторичными мессенджерами, в которые вовлекаются десятки и даже сотни внутриклеточных белков. Для организации адекватного координированного ответа на конкретный внеклеточный сигнал эукариотическая клетка использует две основные стратегии. В соответствии с одной из них происходит изменение активности предсуществующих белков (ферментов, белков цитоскелета, ионных каналов и т.п.) как следствие аллостерических воздействий или в результате ковалентных модификаций (фосфорилирование протеинкиназами или дефосфорилирование). Индуцированные таким образом новые активности белков, в свою очередь, вызывают ответ клетки, основанный на второй стратегии - изменении уровней экспрессии конкретных генов. В результате реализации второй стратегии в клетках меняются число молекул конкретных белков и их качественный состав.

Циклический AMP в роли вторичного мессенджера

В ряде хорошо изученных случаев внеклеточные лиганды после взаимодействия с рецепторами индуцируют образование вторичных мессенджеров через участие GTP-связывающих и GTP-гидролизующих гетеродимерных белков, названных G-белками. Во всех этих системах имеет место последовательность реакций, отображенная на Рис. 3а. Внеклеточный лиганд специфически распознается трансмембранным рецептором, который, в свою очередь, активирует соответствующий G-белок, локализованный на цитоплазматической поверхности мембраны. Активированный G-белок изменяет активность эффектора (обычно фермента или белка ионного канала, в рассматриваемом случае - аденилатциклазы), который повышает внутриклеточную концентрацию вторичного мессенджера (в нашем примере - cAMP). Каждый вид рецептора взаимодействует только с определенным представителем семейства G-белков, а каждый G-белок - со специфическим классом эффекторных молекул. Таким образом, в одном конкретном случае гормон или нейромедиатор, реагируя со своим рецептором, вызывает активацию GS-белка, стимулирующего аденилатциклазу. Этот фермент-эффектор превращает внутриклеточный ATP в cAMP - классический вторичный мессенджер. Внутриклеточный уровень cAMP может специфически понижаться под действием фосфодиэстеразы, которая превращает cAMP в 5"-AMP. cAMP активирует множество cAMP-зависимых протеинкиназ, каждая из которых фосфорилирует определенные белки-субстраты. В большинстве клеток животных присутствуют, по крайней мере, две хорошо охарактеризованные cAMP-зависимые протеинкиназы, фосфорилирующие белки-мишени по остаткам Ser и Thr (серин/треониновые A-киназы). Обе A-киназы представляют собой тетрамеры, состоящие из регуляторного (R) и каталитического (C) димеров полипептидных цепей. R-димер является мишенью для cAMP, с которым он взаимодействует. Это сопровождается диссоциацией комплекса и освобождением C-цепей, обладающих протеинкиназной активностью. Образующиеся полипептиды, свободно диффундируя в цитоплазме, попадают в ядро, где могут фосфорилировать подходящие белки-мишени, в том числе, факторы транскрипции, что сопровождается их активацией и индукцией транскрипции соответствующих генов. Внутриядерными мишенями киназы A являются, в частности, факторы транскрипции CREB, CREMф, AP2, SRF, Sp1, участвующие в контроле большого числа клеточных функций, включая пролиферацию и дифференцировку клеток, метаболизм гликогена, регуляцию ионных каналов и т.д. Специфичность регуляторных воздействий cAMP обеспечивается наличием в клетках определенных типов только им присущих тканеспецифических белков, являющихся субстратами для A-киназ. Например, клетки печени обогащены фосфорилазой-киназой и гликогенсинтазой, активность которых регулируется избирательным фосфорилированием их по cAMP-зависимому механизму, что сопровождается накоплением или освобождением углеводов в гепатоцитах. Адипоциты обогащены липазой, фосфорилирование которой по тому же механизму приводит к освобождению этими клетками свободных жирных кислот. Точно также в клетках других типов, запрограммированных на определенные тканеспецифические функции, содержатся специфические наборы ферментов, активность которых регулируется через их cAMP-зависимое фосфорилирование.

Рис. 3.

а: Rec - рецепторы, Gs - G-белок, AC - аденилатциклаза, ФДЭ - фосфодиэстераза, R и C - соответственно регуляторная и каталитическая субъединицы протеинкиназы, S и S-P - белок-субстрат протеинкиназы и его фосфорилированная форма соответственно 2С* - освобожденный димер каталитической субъединицы А-киназы, Pi - неорганический ортофосфат

б: УФ - ультрафиолетовый свет, ИР - ионизирующая радиация, MMS - метилметансульфонат, SMаза - сфингомиелиназа, MAPKK - киназы, фосфорилирующие MAPK, MAPKKK - киназы, фосфорилирующие MAPKK

в: Образование специфических комплексов циклин-CDK обеспечивает прохождение клетки через соответствующие фазы клеточного цикла. Отмечены места действия белков-ингибиторов клеточного цикла

При понижении концентрации гормонов во внеклеточной среде и уменьшении уровня гормонального воздействия на рецепторы внутриклеточное содержание сАМР быстро уменьшается, так как фосфодиэстераза сразу же превращает сАМР в 5"-AMP. Одновременно происходит дефосфорилирование белков-мишеней A-киназ под действием фосфатаз. Активность некоторых фосфатаз также регулируется по cAMP-зависимому механизму. Кроме того, большинство клеток синтезирует белок, названный ингибитором протеинкиназы (PKI), который блокирует активность C-субъединиц A-киназы. Это сопровождается инактивацией соответствующих факторов транскрипции и подавлением экспрессии регулируемых ими генов.

Передача сигнала с участием протеинкиназ, активируемых митогенами (MAPK)

Протеинкиназы, активируемые митогенами (MAPK - mitogen activated protein kinases), играют исключительно важную роль в регуляции экспрессии генов при всех основных проявлениях жизнедеятельности клеток: их пролиферации и дифференцировке, а также задержке роста и апоптозе в ответ на стрессовые воздействия окружающей среды. После получения внеклеточных сигналов в виде митогенного или генотоксического (мутагенного) воздействия, а также в ответ на действие цитокинов, вызывающих реакции воспаления или апоптоз, в клетках начинают развиваться каскады реакций фосфорилирования, завершающиеся специфической активацией или подавлением активности факторов транскрипции или других регуляторных белков, что сопровождается изменением уровней экспрессии соответствующих генов (Рис. 3б). MAPK-каскады реакций фосфорилирования протеинкиназ и других регуляторных белков обеспечивают пошаговое декодирование первичных эффекторных сигналов путем их передачи от поверхности клеток к ядру или другим внутриклеточным компонентам, завершающееся кооперативными ответами клеток организма.

По крайней мере, 11 известных MAPK животных осуществляют регуляторное фосфорилирование ядерных факторов транскрипции, белков цитоскелета клетки и белков-участников передачи сигнала на последних этапах этого процесса. К членам семейства MAPK относятся: 1) киназы, регулируемые внеклеточными сигналами, ERK1 и 2 (extracellular signal-regulated kinases); 2) киназы N-концевой части фактора транскрипции Jun и протеинкиназы, активируемые стрессом JNK/SAPK б, в и г (NH 2 -terminal Jun kinase/stress activated protein kinases); а также 3) группа MAPK p38, состоящая из четырех белков б, в, г и д (Рис. 3б). MAPK этих групп специфически распознаются и фосфорилируются протеинкиназами 1) MEK1 и 2, известными также под аббревиатурой MKK1 и 2; 2) JNKK1, SEK1, а также MKK4 и 7; 3) MKK3 и 6. Полипептидные цепи MAPK и их киназ MKK обладают высокой гомологией, что указывает на возможное происхождение генов всего каскада через дупликацию генов модуля MAPK.

Активация MAPK своими MKK происходит по общему механизму через фосфорилирование аминокислотных остатков, находящихся в одинаковом контексте. При этом MKK являются представителями редкого класса протеинкиназ с двойной специфичностью: они могут фосфорилировать как остатки Ser/Thr, так и остатки Tyr.

Сами киназы MAPK (MKK) также активируются через фосфорилирование остатков Ser/Thr киназами киназ MAP-киназ (MKKK, или в другом обозначении MAPKKK). В отличие от MAPK, каждая из которых распознается и фосфорилируется специфической протеинкиназой (MKK), любая MKK может быть фосфорилирована и активирована несколькими различными MKKK, включая белки семейства Raf, MEK-киназы (MEKK), c-Mos и MLK (multilineage protein kinase). Такая неразборчивость MKK в отношении своих активирующих партнеров обеспечивает большое разнообразие путей активации MAPK, начиная с определенных стадий каскада реакций фосфорилирования.

Одни из непосредственных мишеней воздействия сигнала, передаваемого с участием MAPK, протоонкогены fos и jun кодируют белки, которые являются основными компонентами многосубъединичного фактора транскрипции AP-1. В состав этого фактора входят гомодимеры или гетеродимеры белков семейства Fos (FosB, Fra-1 и Fra-2) и семейства Jun (c-Jun, Jun-B и Jun-D). Фосфорилирование компонентов AP-1 модулирует (увеличивает или уменьшает) активность фактора. Так, фосфорилирование остатков Ser-63 и Ser-73 в полипептидной цепи c-Jun под действием киназы JNK активирует транскрипцию собственного гена после образования гомодимера c-Jun/c-Jun или гетеродимера c-Jun/ATF С другой стороны, индукция гена c-fos под влиянием митогенов или стресса (например УФ-облучения) опосредована фосфорилированием белка ELK-1, входящего в состав фактора транскрипции TCF (ternary complex factor), который взаимодействует с регуляторной последовательностью SRE промотора этого гена.

Гены, кодирующие белки Fos и Jun, принадлежат к семейству непосредственно ранних генов, индукция которых не требует синтеза белка de novo и происходит чрезвычайно быстро в клетках многих типов в ответ на вышеупомянутые внеклеточные и внутриклеточные стимулы. Имеющиеся данные указывают на то, что многокомпонентные факторы транскрипции AP-1, которые представляют собой гомо- и гетеродимеры белков Fos и Jun, играют ключевую роль в регуляции пролиферации, терминальной дифференцировки и программируемой гибели клеток. Например, гены fos/jun индуцируются временно в покоящихся фибробластах в ответ на действие сыворотки. Однако во время дифференцировки миелоидных клеток происходит их стабильная индукция, и уровень транскрипции генов становится максимальным в зрелых клетках, претерпевших терминальную дифференцировку. Все это указывает на возможность участия белков Fos/Jun в инициации и развитии программы терминальной дифференцировки гематопоэтических клеток, а также поддержании их дифференцированного состояния. Передача сигнала с участием MAP-киназ играет не менее важную роль и в регуляции клеточного цикла.

Клеточный цикл и его регуляция

Рост и деление клеток являются одними из тех фундаментальных процессов, которые лежат в основе жизни любого организма. Прежде чем совершить деление, клетка должна с высокой точностью копировать свой геном (клеточную ДНК) и подготовить его передачу в дочернюю клетку, а также синтезировать многочисленные высоко- и низкомолекулярные соединения. Повторяющаяся совокупность событий, обеспечивающих деление эукариотических клеток, получила название клеточного цикла. Продолжительность клеточного цикла зависит от типа делящихся клеток. Некоторые клетки, например нейроны человека, после достижения стадии терминальной дифференцировки прекращают свое деление вообще. Клетки легких, почек или печени во взрослом организме начинают делиться лишь в ответ на повреждение соответствующих органов. Клетки некоторых типов, например клетки эпителия кишечника, делятся на протяжении всей жизни человека. Но даже у этих быстро пролиферирующих клеток подготовка к делению занимает ~24 ч.

Фазы клеточного цикла

Активный клеточный цикл эукариотических клеток разделяют на четыре фазы. Наиболее легко обнаруживаемой является стадия непосредственного деления клеток - митоза , при котором конденсированные метафазные хромосомы поровну распределяются между дочерними клетками (M-фаза клеточного цикла - mitosis). Митоз был первой идентифицированной фазой клеточного цикла, а все остальные события, происходящие в клетке между двумя митозами, были названы интерфазой . Развитие исследований на молекулярном уровне позволило выделить в интерфазе стадию синтеза ДНК, получившую название S-фазы (synthesis). Эти две ключевые стадии клеточного цикла не переходят непосредственно одна в другую. После окончания митоза до начала синтеза ДНК имеет место кажущаяся пауза (gap) в активности клетки - G1-фаза клеточного цикла, в которой внутриклеточные синтетические процессы подготавливают репликацию генетического материала. Второй перерыв в видимой активности (фаза G2 ) наблюдается после окончания синтеза ДНК перед началом митоза. В фазе G2 клетка осуществляет контроль за точностью произошедшей редупликации ДНК и исправляет обнаруженные сбои. В ряде случаев выделяют пятую фазу клеточного цикла (G0) , когда после завершения деления клетка не вступает в следующий клеточный цикл и длительное время остается в состоянии покоя. Из этого состояния она может быть выведена внешними стимулирующими (митогенными) воздействиями. Все перечисленные фазы клеточного цикла не имеют четких временных и функциональных границ, отделяющих их друг от друга, однако при переходе от одной фазы к другой происходит упорядоченное переключение синтетических процессов, позволяющее на молекулярном уровне дифференцировать эти внутриклеточные события.

Циклины и циклин-зависимые киназы

Клетки вступают в клеточный цикл и осуществляют синтез ДНК в ответ на внешние митогенные стимулы. Лимфокины (например интерлейкины), цитокины (в частности интерфероны) и полипептидные факторы роста, взаимодействуя со своими рецепторами на поверхности клеток, индуцируют каскад реакций фосфорилирования внутриклеточных белков, сопровождающихся передачей сигнала от поверхности клеток к ядру и индукцией транскрипции соответствующих генов. Одними из первых активируются гены, кодирующие белки циклины, получившие свое название от того, что их внутриклеточная концентрация периодически изменяется по мере прохождения клеток через клеточный цикл, достигая максимума на его определенных стадиях. Циклины являются специфическими активаторами семейства циклин-зависимых протеинкиназ (CDK - cyclindependent kinases) - ключевых участников индукции транскрипции генов, контролирующих клеточный цикл. Активация индивидуальной CDK происходит после ее взаимодействия со специфическим циклином, и образование этого комплекса становится возможным после достижения циклином критической концентрации. В ответ на уменьшение внутриклеточной концентрации конкретного циклина происходит обратимая инактивация соответствующей CDK. Некоторые CDK активируются более чем одним циклином. В этом случае группа циклинов, как бы передавая протеинкиназы друг другу, поддерживает их в активированном состоянии длительное время. Такие волны активации CDK возникают на протяжении G1- и S-фаз клеточного цикла.

В настоящее время идентифицировано восемь индивидуальных CDK (CDK1-CDK8), часть которых не участвует непосредственно в регуляции клеточного цикла. Для полипептидных цепей всех CDK характерна высокая (до 75%) структурная гомология. Специфичность же их функционирования обеспечивают уникальные сайты связывания соответствующих активирующих циклинов.

В семействе циклинов (циклин A - циклин J) известны, по крайней мере, 14 индивидуальных белков. Некоторые члены семейства составляют подсемейства. Например, подсемейство циклинов D-типа состоит из трех членов: D1, D2 и D3. Общей структурной особенностью всех циклинов является наличие в их полипептидной цепи последовательности из ~100 аминокислотных остатков, получившей название циклинового бокса . Циклины относятся к быстро обменивающимся белкам с коротким временем полужизни, которое составляет у циклинов D-типа 15-20 мин. Это обеспечивает динамизм их комплексов с циклинзависимыми киназами. За внутриклеточную деградацию циклинов отвечает N-концевая последовательность аминокислотных остатков, названная боксом деструкции (destruction box). При прохождении клеток через клеточный цикл вслед за активацией отдельных CDK по мере необходимости происходит их инактивация. В последнем случае имеет место протеолитическая деградация циклина, находящегося в комплексе с CDK, которая начинающается с бокса деструкции.

Сами по себе циклины не могут полностью активировать соответствующие CDK. Для завершения процесса активации должно произойти специфическое фосфорилирование и дефосфорилирование определенных остатков аминокислот в полипептидных цепях этих протеинкиназ. Большую часть таких реакций осуществляет киназа, активирующая CDK (CAK - CDK activating kinase), которая представляет собой комплекс CDK7 с циклином H. Таким образом, CDK становятся способными выполнять свои функции в клеточном цикле лишь после их взаимодействия с соответствующими циклинами и осуществления посттрансляционных модификаций под действием CAK и других аналогичных белков-регуляторов клеточного цикла.

Начало деления эукариотической клетки

В ответ на митогенный стимул клетка, находящаяся в фазе G 0 или ранней G 1 , начинает свое прохождение через клеточный цикл. В результате индукции экспрессии генов циклинов D и E, которые обычно объединяют в группу циклинов G 1 , происходит увеличение их внутриклеточной концентрации. Циклины D1, D2 и D3 образуют комплекс с киназами CDK4 и CDK6. В отличие от циклина D1 два последних циклина, кроме того, объединяются с CDK Функциональные различия между этими тремя циклинами в настоящее время неизвестны, однако имеющиеся данные указывают на достижение ими критических концентраций при разных стадиях развития фазы G 1 . Эти различия специфичны в отношении типа пролиферирующих клеток.

Активация CDK2/4/6 приводит к фосфорилированию белкового продукта гена ретинобластомы pRb и ассоциированных с ним белков p107 и p130. В начале фазы G1 белок pRb фосфорилирован слабо, что позволяет ему находиться в комплексе с фактором транскрипции E2F, играющим ключевую роль в индукции синтеза ДНК, и блокировать его активность. Полностью фосфорилированная форма pRb освобождает E2F из комплекса, что приводит к активации транскрипции генов, контролирующих репликацию ДНК. Концентрация D-циклинов возрастает на протяжении фазы G 1 клеточного цикла и достигает максимума значений непосредственно перед началом S-фазы, после чего начинает уменьшаться. Однако в это время pRb еще фосфорилирован не полностью, и фактор E2F остается в комплексе в неактивном состоянии. Фосфорилирование pRb завершается под действием CDK2, активированной циклином E. Внутриклеточная концентрация последнего становится максимальной в момент перехода клеточного цикла от фазы G 1 к S-фазе. Таким образом, комплекс циклин E-CDK2 как бы принимает эстафету от комплексов циклина D с CDK4 и CDK6 и завершает фосфорилирование pRb, сопровождающееся освобождением активного фактора транскрипции E2F. В результате начинается синтез ДНК, то есть клетка вступает в S-фазу клеточного цикла.

Синтез ДНК в S-фазе клеточного цикла

После вступления клетки в S-фазу происходит быстрая деградация циклина E и активация CDK2 циклином A. Циклин E начинает синтезироваться в конце фазы G 1 и его взаимодействие с CDK2 является необходимым условием для вступления клетки в S-фазу и продолжения синтеза ДНК. Этот комплекс активирует синтез ДНК через фосфорилирование белков в областях начала репликации. Сигналом к завершению S-фазы и переходу клетки к фазе G2 является активация циклином A другой киназы CDK1 с одновременным прекращением активации CDK Задержка между окончанием синтеза ДНК и началом митоза (фаза G2) используется клеткой для контроля полноты и точности произошедшей репликации хромосом.

Сигнал к началу деления клетки (митоза) исходит от фактора MPF (M phase promoting factor), стимулирующего M-фазу клеточного цикла. MPF представляет собой комплекс киназы CDK1 с активирующими ее циклинами A или B. Складывается впечатление, что комплекс CDK1-циклин A играет более важную роль в завершении S-фазы и подготовке клетки к делению, тогда как комплекс CDK1-циклин B преимущественно осуществляет контроль последовательности событий, связанных с митозом. В настоящее время идентифицировано два циклина B-типа: B1 и B Хотя оба циклина, по-видимому, выполняют одинаковые функции, они действуют в разных частях клетки. Так, циклин B1 ассоциирован преимущественно с микротрубочками, тогда как циклин B2 обнаруживают в районе аппарата Гольджи.

Циклины B1 и B2 присутствуют в очень малых концентрациях в фазе G 1 . Их концентрация начинает увеличиваться в конце S- и на протяжении G 2 -фаз, достигая своего максимума во время митоза, что приводит к замещению ими циклина A в комплексе с CDK1. Однако этого оказывается недостаточным для полной активации протеинкиназы. Функциональная компетентность CDK1 достигается после серии ее фосфорилирований и дефосфорилирований по специфическим остаткам аминокислот. Такой тонкий контроль необходим для предотвращения вступления клеток в митоз до полного завершения синтеза ДНК.

Деление клетки начинается только после того, как CDK1, находящаяся в комплексе с циклином B, фосфорилируется по остаткам Thr-14 и Tyr-16 протеинкиназой WEE1, а также по остатку Thr-161 протеинкиназой CAK и затем дефосфорилируется по остаткам Thr-14 и Tyr-15 фосфатазой CDC25. Активированная таким образом CDK1 фосфорилирует в ядре структурные белки, в том числе нуклеолин, ядерные ламины и виментин. После этого ядро начинает проходить через цитологически хорошо различимые, но пока недостаточно изученные на молекулярном уровне стадии митоза. Первая стадия митоза - профаза - начинается после того, как CDK1 полностью фосфорилируется, за ней следуют метафаза, анафаза и телофаза, завершающиеся делением клетки - цитокинезом. Следствием этих процессов является правильное распределение реплицированных хромосом, ядерных и цитоплазматических белков, а также других высокомолекулярных и низкомолекулярных соединений в дочерние клетки. После завершения цитокинеза происходит разрушение циклина B, сопровождаемое инактивацией CDK1, что приводит к вступлению клетки в фазу G 1 или G 0 клеточного цикла.

Фаза G0 клеточного цикла

Клетки некоторых типов на определенных стадиях дифференцировки могут прекращать свое деление, полностью сохраняя свою жизнеспособность. Такое состояние клеток получило название фазы G 0 . Клетки, достигшие состояния терминальной дифференцировки, уже не могут выйти из этой фазы. В то же время клетки, для которых характерна чрезвычайно низкая способность к делению, например гепатоциты, могут снова вступать в клеточный цикл после удаления части печени.

Переход клеток в состояние покоя становится возможным благодаря функционированию высокоспецифических ингибиторов клеточного цикла. При участии этих белков клетки могут прекращать пролиферацию в неблагоприятных условиях окружающей среды, при повреждении ДНК или появлении грубых ошибок ее репликации. Такие паузы используются клетками для репарации возникших повреждений.

Ингибиторы клеточного цикла

В клеточном цикле имеются две основные стадии (точки перехода, контрольные точки R - restriction points), на которых могут быть реализованы негативные регуляторные воздействия, останавливающие продвижение клеток через клеточный цикл. Одна из этих стадий контролирует переход клетки к синтезу ДНК, а другая - начало митоза. Имеются и другие регулируемые этапы клеточного цикла.

Переход клеток от одной фазы клеточного цикла к другой контролируется на уровне активации CDK их циклинами с участием ингибиторов циклинзависимых киназ CKI. По мере необходимости эти ингибиторы могут активироваться и блокировать взаимодействие CDK со своими циклинами, а следовательно, и клеточный цикл как таковой. После изменения внешних или внутренних условий клетка может продолжить пролиферацию или вступить на путь апоптоза.

Имеется две группы CKI: белки семейств p21 и INK4 (inhibitor of CDK4), члены которых внутри семейств обладают похожими структурными свойствами. Семейство ингибиторов p21 включает в себя три белка: сам p21, p27 и p57. Поскольку эти белки были описаны независимо несколькими группами, до сих пор используются их альтернативные названия. Так, белок p21 известен также под именами WAF1 (wild-type p53 activated fragment 1), CIP1 (CDK2 interacting protein 1), SDI1 (senescent derived inhibitor 1) и mda-6 (melanoma differentiation associated gene). Синонимами p27 и p57 являются соответственно KIP1 и KIP2 (kinase inhibiting proteins 1 and 2). Все эти белки обладают широкой специфичностью действия и могут ингибировать различные CDK. В отличие от этого группа ингибиторов INK4 более специфична. В нее входят четыре белка: p 15INK4B , p 16INK4A , p 18INK4C и p 19INK4D . До недавнего времени предполагалось, что все ингибиторы семейства INK4 функционируют во время фазы G 1 клеточного цикла, подавляя активность киназы CDK4. Однако обнаруженный недавно второй белковый продукт гена INK4A - p19 ARF , взаимодействует с регуляторным фактором MDM2 белка p53 и инактивирует фактор. Это сопровождается увеличением стабильности белка p53 и остановкой клеточного цикла.

Механизмы контроля перехода от G 1 - к S-фазе клеточного цикла

До начала активного клеточного цикла белок p27, находясь в высокой концентрации, предотвращает активацию протеинкиназ CDK4 или CDK6 циклинами D1, D2 или D3. В таких условиях клетка остается в фазе G 0 или ранней фазе G1 до получения митогенного стимула. После адекватной стимуляции происходит уменьшение концентрации ингибитора p27 на фоне возрастания внутриклеточного содержания циклинов D. Это сопровождается активацией CDK и, в конечном счете, фосфорилированием белка pRb, освобождением связанного с ним фактора транскрипции E2F и активацией транскрипции соответствующих генов.

На этих ранних стадиях фазы G 1 клеточного цикла концентрация белка p27 все еще остается довольно высокой. Поэтому после прекращения митогенной стимуляции клеток содержание этого белка быстро восстанавливается до критического уровня и дальнейшее прохождение клеток через клеточный цикл блокируется на соответствующем этапе G 1 . Эта обратимость возможна до тех пор, пока фаза G 1 в своем развитии не достигает определенной стадии, называемой точкой перехода, после прохождения которой клетка становится коммитированной к делению, и удаление факторов роста из окружающей среды не сопровождается ингибированием клеточного цикла. Хотя с этого момента клетки становятся независимыми от внешних сигналов к делению, они сохраняют способность к самоконтролю клеточного цикла.

Ингибиторы CDK семейства INK4 (p15, p16, p18 и p19) специфически взаимодействуют с киназами CDK4 и CDK6. Белки p15 и p16 идентифицированы как супрессоры опухолевого роста, и их синтез регулируется белком pRb. Все четыре белка блокируют активацию CDK4 и CDK6, либо ослабляя их взаимодействие с циклинами, либо вытесняя их из комплекса. Хотя оба белка p16 и p27 обладают способностью ингибировать активность CDK4 и CDK6, первый имеет большее сродство к этим протеинкиназам. Считается, что если концентрация p16 повышается до уровня, при котором он полностью подавляет активность киназ CDK4/6, белок p27 становится основным ингибитором киназы CDK

На ранних стадиях клеточного цикла здоровые клетки могут распознавать повреждения ДНК и реагировать на них задержкой прохождения клеточного цикла в фазе G 1 до репарации повреждений. Например, в ответ на повреждения ДНК, вызванные ультрафиолетовым светом или ионизирующей радиацией, белок p53 индуцирует транскрипцию гена белка p21. Повышение его внутриклеточной концентрации блокирует активацию CDK2 циклинами E или A. Это останавливает клетки в поздней фазе G 1 или ранней S-фазе клеточного цикла. В это время клетка сама определяет свою дальнейшую судьбу - если повреждения не могут быть устранены, она вступает в апоптоз, т.е. совершает самоубийство.

Регуляция перехода клеточного цикла от фазы G 2 к фазе M

Ответ клетки на повреждения ДНК может наступить и позднее - перед началом митоза. И в этом случае белок p53 индуцирует синтез ингибитора p21, который предотвращает активацию киназы CDK1 циклином B и задерживает дальнейшее развитие клеточного цикла. Само прохождение клетки через митоз также жестко контролируется - последующие стадии не начинаются без полного завершения предыдущих. Некоторые из этих ингибиторов были идентифицированы у дрожжей, но их гомологи у животных пока остаются неизвестными. Например, недавно описаны два белка дрожжей BUB1 (budding uninhibited by benomyl) и MAD2 (mitotic arrest deficient), которые контролируют присоединение конденсированных хромосом к митотическому веретену в метафазе митоза. До завершения правильной сборки этих комплексов белок MAD2 образует комплекс с протеинкиназой CDC20 и инактивирует ее. CDC20 после активации фосфорилирует белки и в результате блокирует те их функции, которые препятствуют расхождению каждой из двух гомологичных хроматид во время цитокинеза.

Вторичные мессенджеры распространяют сигналы между белками, которые находятся на определенном расстоянии друг от друга.

ЦАМФ и Са2+ представляют собой распространенные вторичные мессенджеры.

При передаче сигналов используются как белки, так и небольшие молекулы, обладающие характерными свойствами . Небольшие молекулы, которые функционируют как внутриклеточный сигнал, или вторичный мессенджер, имеют ряд преимуществ перед белками в качестве сигнального интермедиата. Небольшие молекулы быстро образуются и столь же быстро распадаются.

Поскольку они синтезируются быстро, они могут действовать в высоких концентрациях, так что их сродство к белкам-мишеням может быть невысоким. Низкое сродство позволяет малым молекулам моментально диссоциировать так, что передача сигнала может быть быстро прервана, когда свободные молекулы вторичного мессенджера распадаются или инактивируются.

Поскольку молекулы вторичного мессенджера невелики, они способны быстро распространяться по клетке, хотя во многих клетках существуют механизмы, препятствующие этому. Таким образом, при выработке быстрой реакции на сигнал, особенно связанной с преодолением расстояния, вторичные мессенджеры обладают рядом преимуществ перед белками.

Вторичные мессенджеры используются также, когда необходимо одновременно адресовать сигналы многим белкам-мишеням. Эти их преимущества часто компенсируют отсутствие у них каталитической активности и неспособность одновременно связывать несколько молекул.

На рисунке ниже представлены внутриклеточные вторичные мессенджеры , возникшие в клетках в ходе эволюции. Количество их невелико, что вызывает удивление. Некоторые представляют собой нуклеотиды, образовавшиеся из основных метаболических предшественников. Это цАМФ, цГМФ, ффГффф и циклоАДФ-рибоза. Прочие растворимые вторичные мессенджеры включают фосфорилированный сахар, инозитол-1,4,5-трифосфат (IP3) и двухвалентный ион Са2+, а также свободный радикал, окись азота (NO).

К вторичным мессенджерам липидной природы относятся диацилглицерин и фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат, фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат, сфингозин-1-фосфат и фосфатидная кислота.

К числу первой из сигнальных молекул, описанной как вторичный мессенджер, относится цАМФ. Это название он получил потому, что цАМФ образуется в клетках животных как второй внутриклеточный сигнал, в ответ на действие многих внеклеточных гормонов, т. е. первых мессенджеров на пути передачи сигнала. цАМФ принимает участие в передаче информации различным регуляторным белкам у прокариот, грибов и в клетках млекопитающих (его присутствие у высших растений пока не доказано).

Активность аденилатциклазы , фермента который синтезирует цАМФ из АТФ, регулируется различными путями, в зависимости от организма, в котором она функционирует. У животных аденилатциклаза представляет собой интегральный белок плазматической мембраны, и ее множественные формы активируются при действии различных агентов. В клетках животных аденилатциклаза обычно активируется под действием Gs, который первоначально был описан как регулятор активности фермента. Некоторые ферменты грибов также активируются G-белками. Циклазы бактерий характеризуются более разнообразными системами регуляции активности.

цАМФ удаляется двумя способами. Он может выходить из клетки под действием АТФ-зависимого анионного насоса, но гораздо чаще гидролизуется представителями семейства фосфодиэстераз циклических нуклеотидов. Это большая группа белков, которые сами находятся под множественным регуляторным контролем.

Прототипом регулятора цАМФ у животных является цАМФ-зависимая протеинкиназа, однако вскоре после идентификации этого фермента у был обнаружен цАМФ-регулируемый фактор транскрипции, а в настоящее время известны и другие эффекторы. Система цАМФ остается прототипом сигнальной системы эукариот. Это выражается в том, что ее компоненты представляют собой почти все известные разновидности сигнальных молекул и демонстрируют все виды их взаимодействий: гормон, рецептор, G-белок, аденилатциклаза, протеинкиназа, фосфодиэстераза и выводящий насос.

Протеинкиназа РКА , активность которой стимулируется вторичным мессенджером, представляет собой тетрамер, состоящий из двух каталитических (С) и двух регуляторных (R) субъединиц. Субъединица R связывается с каталитической субъединицей посредством сайта связывания субстрата, и, таким образом, С поддерживается в неактивном состоянии. Каждая субъединица R связывает две молекулы циклического нуклеотида, т. е. четыре молекулы цАМФ на холофермент РКА. Когда сайты связывания оказываются заполненными, димер субъединиц R быстро диссоциирует, оставляя две высокоактивные свободные каталитичнеские субъединицы.

Сродство R к С в присутствии и в отсутствие цАМФ , различается примерно в 10 000 раз. Выраженный кооперативный характер связывания цАМФ приводит к очень крутому подъему кривой активации и к порогу, ниже которого существенной активации РКА не происходит. Таким образом, активность РКА резко возрастает в очень узком диапазоне концентрации цАМФ. РКА также регулируется за счет фосфорилирования петли активации. Фосфорилирование происходит одновременно с трансляцией и необходимо для сборки тетрамера R2C2.

В основном РКА представляют собой цитозольные белки и занимают в клетке специфические места, связываясь с каркасными структурами органелл (белки, закрепляющие А-киназу, или АКАР). Эти АКАР способствуют фосфорилированию мембранных белков, включающих GPCR, переносчики и ионные каналы. Они также обеспечивают локализацию РКА в других местах: в митохондриях, цитоскелете и в центросомах. АКАР часто содержат сайты связывания для таких регуляторных молекул, как фосфопротеинфосфатазы и другие протеинкиназы, которые необходимы для координации функционирования нескольких сигнальных путей и интеграции выходных сигналов.

Обычно РКА фосфорилируют субстраты с участием последовательности Arg-Arg-Xaa-Ser-гидрофобный остаток, которая у большой группы киназ узнает остатки основных аминокислот, расположенные перед сайтом фосфорилирования. РКА участвует в регуляции активности различных внутриклеточных белков, от ионных каналов до факторов транскрипции, и благодаря субстратной специфичности фермента, часто, на основании анализа первичной структуры белка, можно предсказать, является ли он субстратом для киназы.

РКА фосфорилирует Ser 133 в CREB, представляющем собой белок, связывающийся с цАМФ-зависимым элементом, который в основном обеспечивает влияние цАМФ на транскрипцию многих генов.

Вторичные посредники (вторичные мессенджеры) - это малые сигнальные молекулы, компоненты системы передачи сигнала в клетке. Вторичные посредники являются компонентами каскадов передачи сигнала, быстро образуются и далее активируют эффекторные белки, которые опосредуют ответ клетки.

К наиболее распространенным вторичным посредникам относятся цАМФ (Аденозинмонофосфат) и другие циклические нуклеотиды, ионы кальция, оксид азота.Концентрация вторичных посредников в цитозоле может быть повышена различными путями:

Активацией ферментов, которые их синтезируют, как, например в случае активации циклаз, образующих циклические формы нуклеотидов (цАМФ, цГМФ), -путем открывания ионных каналов, позволяющих потоку ионов металлов, например, ионов кальция войти в клетку. Эти малые молекулы могут далее связывать и активировать эффекторные молекулы - протеинкиназы, ионные каналы и разнообразные другие белки.

А. Циклический АМФ

Биосинтез. Нуклеотид синтезируется мембранными аденилатциклазами - семейством ферментов, катализирующих реакцию циклизации АТФ (АТР) с образованием цАМФ и неорганического пирофосфата. Расщепление цАМФ с образованием АМФ (AMP) катализируется фосфодиэстеразами, которые ингибируются при высоких концентрациях метилированных производных ксантина, например кофеином.

Активность аденилатциклазы контролируется G-белками, которые в свою очередь сопряжены с рецепторами третьего типа, управляемыми внешними сигналами. Большинство G-белков (Gs-белки) активируют аденилатциклазу, некоторые G-белки ее ингибируют (Gi-белки). Некоторые аденилатциклазы активируются комплексом Са2+.

Механизм действия. цАМФ является аллостерическим эффектором протеинкиназА (ПК-Α) и ионных каналов. В неактивном состоянии ПК-Α является тетрамером, две каталитические субъединицы (К-субъединицы) которого ингибированы регуляторными субъединицами (Р-субъединицы) (аутоингибирование).

При связывании цАМФ Р-субъединицы диссоциируют из комплекса и К-единицы активируются. Фермент может фосфорилировать определенные остатки серина и треонина в более чем 100 различных белках, в том числе во многих ферментах и факторах транскрипции. В результате фосфорилирования изменяется функциональная активность этих белков.

Наряду с цАМФ функции вторичного мессенджера может выполнять и цГМФ (гуанозинмонофосфат). Оба соединения различаются по метаболизму и механизму действия.

Б. Роль ионов кальция

Уровень ионов кальция. Концентрация ионов Са2+ в цитоплазме нестимулированной клетки очень низка. Низкий уровень поддерживается кальциевыми АТФ-азами (кальциевыми насосами) и натрий-кальциевыми обменниками. Резкое повышение концентрации ионов Са2+ в цитоплазме происходит в результате открывания кальциевых каналов плазматической мембраны или внутриклеточных кальциевых депо (гладкого и шероховатого эндоплазматического ретикулума). Открывание каналов может быть вызвано деполяризацией мембран или действием сигнальных веществ, нейромедиаторов (глутамат и АТФ), вторичных мессенджеров (цАМФ), а также вещества растительного происхождения рианодина. В цитоплазме и клеточных органеллах имеется множество белков способных связывать Са2+, некоторые из них выполняют роль буфера.

При высокой концентрации в цитоплазме ионы Са2+ оказывает на клетку цитотоксическое действие. Поэтому уровень кальция в отдельной клетке испытывает кратковременные всплески, увеличиваясь в 5-10 раз.

Действие кальция опосредовано специальными Са2+-связывающими белками («кальциевыми сенсорами»), к которым принадлежат аннексин, кальмодулин и тропонин. Кальмодулин - сравнительно небольшой белок - присутствует во всех животных клетках.

Мессенджеры – низкомолекулярные вещества, переносящие сигналы гормонов внутри клетки. Они обладают высокой скоростью перемещения, расщепления или удаления (Са 2+ , цАМФ, цГМФ, ДАГ, ИТФ).

Нарушения обмена мессенджеров приводят к тяжелым последствиям. Например, форболовые эфиры, которые являются аналогами ДАГ, но в отличие от которого в организме не расщепляются, способствуют развитию злокачественных опухолей.

цАМФ открыта Сазерлендом в 50 годах прошлого века. За это открытие он получил Нобелевскую премию. цАМФ участвует в мобилизации энергетических запасов (распад углеводов в печени или триглицеридов в жировых клетках), в задержке воды почками, в нормализации кальциевого обмена, в увеличении силы и частоты сердечных сокращений, в образовании стероидных гормонов, в расслаблении гладких мышц и так далее.

цГМФ активирует ПК G, ФДЭ, Са 2+ -АТФазы, закрывает Са 2+ -каналы и снижает уровень Са 2+ в цитоплазме.

Ферменты

Ферменты каскадных систем катализируют:

• образование вторичных посредников гормонального сигнала;
• активацию и ингибирование других ферментов;
• превращение субстратов в продукты;

Аденилатциклаза (АЦ)

Гликопротеин с массой от 120 до 150 кДа, имеет 8 изоформ, ключевой фермент аденилатциклазной системы, с Mg 2+ катализирует образование вторичного посредника цАМФ из АТФ.

АЦ содержит 2 –SH группы, одна для взаимодействия с G-белком, другая для катализа. АЦ содержит несколько аллостерических центров: для Mg 2+ , Mn 2+ , Ca 2+ , аденозина и форсколина.

Есть во всех клетках, располагается на внутренней стороне клеточной мембраны. Активность АЦ контролируется: 1) внеклеточными регуляторами - гормонами, эйкозаноидами, биогенными аминами через G-белки; 2) внутриклеточным регулятором Са 2+ (4 Са 2+ -зависимые изоформы АЦ активируются Са 2+).

Протеинкиназа А (ПК А)

ПК А есть во всех клетках, катализируют реакцию фосфорилирования ОН- групп серина и треонина регуляторных белков и ферментов, участвует в аденилатциклазной системе, стимулируется цАМФ. ПК А состоит из 4 субъединиц: 2 регуляторных R (масса 38000 Да) и 2 каталитических С (масса 49000 Да). Регуляторные субъединицы имеют по 2 участка связывания цАМФ. Тетрамер не обладает каталитической активностью. Присоединение 4 цАМФ к 2 субъединицам R приводит к изменению их конформации и диссоциации тетрамера. При этом высвобождаются 2 активные каталитические субъединицы С, которые катализируют реакцию фосфорилирования регуляторных белков и ферментов, что изменяет их активность.

Протеинкиназа С (ПК С)

ПК С участвует в инозитолтрифосфатной системе, стимулируется Са 2+ , ДАГ и фосфатидилсерином. Имеет регуляторный и каталитический домен. ПК С катализирует реакцию фосфорилирования белков-ферментов.

Протеинкиназа G (ПК G) есть только в легких, мозжечке, гладких мышцах и тромбоцитах, участвует в гуанилатциклазной системе. ПК G содержит 2 субъединицы, стимулируется цГМФ, катализирует реакцию фосфорилирования белков-ферментов.

Фосфолипаза С (ФЛ С)

Гидролизует фосфоэфирную связь в фосфатидилинозитолах с образованием ДАГ и ИФ 3 , имеет 10 изоформ. ФЛ С регулируется через G-белки и активируется Са 2+ .

Фосфодиэстеразы (ФДЭ)

ФДЭ превращает цАМФ и цГМФ в АМФ и ГМФ, инактивируя аденилатциклазную и гуанилатциклазную систему. ФДЭ активируется Са 2+ , 4Са 2+ -кальмодулином, цГМФ.

NO-синтаза – это сложный фермент, представляющий собой димер, к каждой из субъединиц которого присоединено несколько кофакторов. NO-синтаза имеет изоформы.

Синтезировать и выделять NO способно большинство клеток организма человека и животных, однако наиболее изучены три клеточные популяции: эндотелий кровеносных сосудов, нейроны и макрофаги. По типу синтезирующей ткани NO-синтаза имеет 3 основные изоформы: нейрональную, макрофагальную и эндотелиальную (обозначаются соответственно как NO-синтаза I, II и III).

Нейрональная и эндотелиальная изоформы NO-синтазы постоянно присутствуют в клетках в небольших количествах, и синтезируют NO в физиологических концентрациях. Их активирует комплекс кальмодулин-4Са 2+ .

NO-синтаза II в макрофагах в норме отсутствует. При воздействии на макрофаги липополисахаридов микробного происхождения или цитокинов они синтезируют огромное количество NO-синтазы II (в 100-1000 раз больше чем NO-синтазы I и III), которая производит NO в токсических концентрациях. Глюкокортикоиды (гидрокортизон, кортизол), известные своей противовоспалительной активностью, ингибируют экспрессию NO-синтазы в клетках.

Действие NO

NO - низкомолекулярный газ, легко проникает через клеточные мембраны и компоненты межклеточного вещества, обладает высокой реакционной способностью, время его полураспада в среднем не более 5 с, расстояние возможной диффузии небольшое, в среднем 30 мкм.

В физиологических концентрациях NO оказывает мощное сосудорасширяющее действие :

· Эндотелий постоянно продуцирует небольшие количества NO.

· При различных воздействиях – механических (например, при усилении тока или пульсации крови), химических (липополисахариды бактерий, цитокины лимфоцитов и кровяных пластинок и т.д.) – синтез NO в эндотелиальных клетках значительно повышается.

· NO из эндотелия диффундирует к соседним гладкомышечным клеткам стенки сосуда, активирует в них гуанилатциклазу, которая синтезирует через 5с цГМФ.

· цГМФ приводит к снижению уровня ионов кальция в цитозоле клеток и ослаблению связи между миозином и актином, что и позволяет клеткам через 10 с расслабляться.

На этом принципе действует препарат нитроглицерин. При расщеплении нитроглицерина образуется NO, приводящий к расширению сосудов сердца и снимающий в результате этого чувство боли.

NO регулирует просвет мозговых сосудов. Активация нейронов какой-либо области мозга приводит к возбуждению нейронов, содержащих NO-синтазу, и/или астроцитов, в которых также может индуцироваться синтез NO, и выделяющийся из клеток газ приводит к локальному расширению сосудов в области возбуждения.

NO участвует в развитии септического шока, когда большое количество микроорганизмов, циркулирующих в крови, резко активируют синтез NO в эндотелии, что приводит к длительному и сильному расширению мелких кровеносных сосудов и как следствие – значительному снижению артериального давления, с трудом поддающемуся терапевтическому воздействию.

В физиологических концентрациях NO улучшает реологические свойства крови :

NO, образующийся в эндотелии, препятствует прилипанию лейкоцитов и кровяных пластинок к эндотелию и также снижает агрегацию последних.

NO может выступать в роли антиростового фактора, препятствующего пролиферации гладкомышечных клеток стенки сосудов, важного звена в патогенезе атеросклероза.

В больших концентрациях NO оказывает на клетки (бактериальные, раковые и т.д) цитостатическое и цитолитическое действие следующим образом:

· при взаимодействии NO с радикальным супероксид анионом образуется пероксинитрит (ONOO-), который является сильным токсичным окислителем;

· NO прочно связывается с геминовой группой железосодержащих ферментов и ингибирует их (ингибирование митохондриальных ферментов окислительного фосфорилирования блокирует синтез АТФ, ингибирование ферментов репликации ДНК способствуют накоплению в ДНК повреждений).

· NO и пероксинитрит могут непосредственно повреждать ДНК, это приводит к активации защитных механизмов, в частности стимуляции фермента поли(АДФ-рибоза) синтетазы, что еще больше снижает уровень АТФ и может приводить к клеточной гибели (через апоптоз).

Похожая информация.

Жизнь любой клетки, включая глобальные процессы ее роста, деления и даже гибели, зависит от внешних регуляторных сигналов, которые она воспринимает. Такими сигналами могут быть физические воздействия (температура, ионизирующее и другое электромагнитное излучение) или многочисленные химические соединения. Хорошо изученными веществами, которые организм использует для регуляции жизнедеятельности клеток, являются, например стероидные гормоны, цитокины или факторы роста, которые, достигая клеток-мишеней, вызывают в них специфические метаболические изменения, связанные в том числе и с изменением экспрессии больших групп генов. Не менее сильный и часто также специфический ответ вызывают различные физиологически активные вещества экзогенного происхождения, например феромоны или токсины.

Все эти сигналы, передающиеся через соответствующие сигнальные молекулы, являются первичными по отношению к тем каскадам биохимических реакций, которые запускаются в клетках в ответ на их воздействие. Первичные сигналы распознаются клетками благодаря наличию у них специальных молекул-рецепторов белковой природы, взаимодействующих с первичными сигнальными молекулами или воздействиями физической природы. Первичный сигнал, как правило, не действует прямо на те метаболические процессы в клетке, для регуляции которых он предназначен. Вместо этого воспринимающий его рецептор инициирует образование в клетке промежуточных химических соединений, запускающих внутриклеточные процессы, воздействие на которые было целью первичного внеклеточного сигнала. Поскольку такие промежуточные соединения несут в себе информацию о первичном регуляторном сигнале и являются вторичными его переносчиками, они получили название вторичных мессенджеров. Ими могут быть различные ионы, циклические нуклеотиды, продукты деградации липидов и целый ряд других химических соединений биогенного происхождения.

Использование эукариотами системы вторичных мессенджеров переводит их на новый уровень интеграции всех метаболических и катаболических процессов, что необходимо для существования многоклеточных организмов. В частности, вторичные мессенджеры позволяют многократно усиливать первичный регуляторный сигнал от внеклеточных регуляторных молекул, которые благодаря этому осуществляют свое действие, находясь в небольших концентрациях во внеклеточном пространстве. Кроме того, многие группы клеток и тканей приобретают способность к однотипной и одновременной реакции на первичный регуляторный сигнал, например на действие гормона какого-либо органа эндокринной системы. Это обеспечивает возможность быстрой адаптации многоклеточного организма к изменяющимся условиям внутренней и окружающей среды.

Трансмембранный перенос первичных сигналов. Для того чтобы первичный регуляторный сигнал достиг ядра и оказал свое воздействие на экспрессию генов-мишеней, он должен пройти через двухслойную мембрану именно тех клеток, которым он предназначен. Как правило, это достигается благодаря наличию на поверхности клеток рецепторов белковой природы, специфически выбирающих из окружающей среды сигналы, распознать которые они в состоянии (рис. I.22). В простейшем случае, когда в качестве низкомолекулярных регуляторов выступают гидрофобные химические соединения, растворимые в липидах мембран (например стероидные гормоны), для их переноса не используются рецепторы, и они проникают в клетку путем радиальной диффузии. Внутри клеток такие соединения специфически взаимодействуют с белковыми рецепторами, а образующийся комплекс переносится в ядро, где оказывает свое регуляторное воздействие на транскрипцию соответствующих генов (см. рис. I.22,а ).

В отличие от этого рецепторы мембран, ориентированные во внеклеточное пространство, обладают способностью осуществлять транспорт лиганда-регулятора внутрь клеток посредством эндоцитоза (поглощения путем втягивания мембраны) комплекса лиганд-рецептор в составе мембранных везикул. Такой механизм используется, в частности, для переноса внутрь клеток молекул холестерина, ассоциированных с рецепторами липопротеинов низкой плотности (см. рис. I.22,б ). Другой тип рецепторов, ориентированных на внеклеточные лиганды, – это трансмембранные молекулы или группа молекул. Взаимодействие с лигандом внешней части таких молекул сопровождается индукцией ферментативной активности, ассоциированной с внутриклеточной частью того же самого полипептида (см. рис. I.22,в ). Примерами подобных рецепторов, обладающих активностью тирозиновых протеинкиназ, являются рецепторы инсулина, эпидермального фактора роста или фактора роста тромбоцитов. В синапсах нейронов и местах контакта нейромышечных тканей лиганды-нейромедиаторы (например ацетилхолин или -аминомасляная кислота) взаимодействуют с трансмембранными ионными каналами (см. рис. I.22,г ). В ответ на это происходит открытие ионных каналов, сопровождаемое перемещением ионов через мембрану и быстрым изменением трансмембранного электрического потенциала. Другие трансмембранные рецепторы осуществляют связь белков внеклеточного матрикса с микрофиламентами цитоскелета клеток и регуляцию формы клеток, зависящую от внеклеточного матрикса, их подвижности и роста (см. рис. I.22,д ). Наконец, большая группа внеклеточных сигналов распознается рецепторами, ассоциированными на внутренней поверхности мембраны с GTP-связывающими белками, которые, в свою очередь, в ответ на первичный сигнал начинают синтез вторичных мессенджеров, регулирующих активность внутриклеточных белков (см. рис. I.22,е ). Классификация по структурному признаку рецепторов, осуществляющих перенос сигнала в клетки через мембраны, приведена в табл. I.12.

Рис. I.22. Способы передачи внеклеточных регуляторных сигналов через мембраны эукариотических клеток (а – е )

Y и Y–P – нефосфорилированные и фосфорилированные остатки Tyr в белках соответственно. Показано также превращение предшественника X во вторичный мессенджер Z

Все рецепторы, участвующие в трансмембранной передаче сигнала, подразделяют на три класса. При этом, как правило, учитывается сходство или различие вторичных структур субъединиц, а не особенности их аминокислотных последовательностей. Рецепторы 1-го класса образуют олигомерные структуры вокруг пор в мембранах. Перенос сигнала в этом случае происходит в результате открытия или (в одном случае) закрытия ионных каналов. Основная часть рецепторов 2-го класса погружена в мембраны, и каждая из субъединиц содержит последовательности, распознаваемые G-белками (см. ниже). Для всех субъединиц этого класса характерно наличие трансмембранной (ТМ) последовательности, которая 7 раз пересекает мембрану. Субъединицы рецепторов 3-го класса минимально погружены в мембраны, что обеспечивает подвижность рецепторов и возможность их интернализации (перехода в цитоплазму клеток в составе мембранной везикулы). Большая часть полипептидных цепей этих субъединиц экспонирована наружу клеток.

Вторичные мессенджеры. Гипотеза о том, что действие гормонов на метаболизм клеток и экспрессию генов опосредуется внутриклеточными вторичными мессенджерами, впервые появилась после открытия в конце 1950-х годов Е. Сазерлендом циклического аденозин-3’,5’-монофосфата (cAMP). К настоящему времени список вторичных мессенджеров расширился и включает циклический гуанозин-3’,5’-монофосфат, фосфоинозитиды, ионы Ca 2+ и H + , метаболиты ретиноевой и арахидоновой кислот, закись азота (NO), а также некоторые другие химические соединения биогенного происхождения. Подробное рассмотрение особенностей механизма действия каждого из них выходит за рамки данной монографии, хотя все они могут оказывать специфическое влияние на экспрессию генов.